Loading...

MediPark Košice

Medicínsky univerzitný vedecký park v Košiciach

1. Vývoj molekulovo-genetických metód na detekciu a genotypizáciu mikroorganizmov s využitím metód genómiky a proteomiky

Pre vývoj nových diagnostických metód boli využité molekulovobiologické testy na báze PCR, RT-PCR, real-time PCR a ich modifikácií. Vírusová nukleová kyselina (DNA alebo RNA) bola izolovaná z klinického materiálu (sérum, krv, infikované bunky, tkanivový homogenát, stery) s využitím extrakcie s Trizolom, alebo metódami na komerčných kolónkach. Prepis RNA bol urobený s random hexamermi, alebo gén špecifickým primerom s využitím reverznej transkriptázy. PCR primery boli selektované z konzervatívnych oblasti genómov vírusových izolátov s využitím počítačových programov. PCR bola robená s využitím rôznych DNA polymeráz. Optimalizácia diagnostických testov bola dosiahnutá zmenou reakčných podmienok (koncentrácia komponent, teplotá annalingu).

Za účelom simultánnej detekcie troch flavivírusov vyskytujúcich sa v strednej Európe (vírus horúčky Západného Nílu - WNV, Usutu vírus – USUV a vírus kliešťovej encefalitídy - TBEV) bolo navrhnutie špecifickej a senzitívnej metódy. Boli navrhnuté a optimalizované dve vysoko senzitívne a špecifické metódy. Nested RT-PCR reakciami zameranými na detekciu flavivírusových génov kódujúcich vírusovú RNA polymerázu a obalový proteín bola preukázaná citlivosť minimálne 4,5×101 PFU/ml WNV línie II, 2,5×102 PFU/ml WNV línie I, 4×100 TCID50/ml USUV a 2,2×102 TCID50/ml TBEV. V kombinácii s reverznou hybridizáciou bola po generickej duplex PCR dosiahnutá citlivosť 4,5×100 PFU/ml WNV línie II, 2,5×103 PFU/ml WNV línie I, 4×100 TCID50/ml USUV a 2,2×102 TCID50/ml TBEV.

2. Monitorovanie epidemiologicko/epizootologickej situácie u závažných chorôb ľudí a zvierat klasickými metódami a metódami molekulovej epidemiológie/epizootológie

Pre potreby molekulovej epizootológie genómy vírusových izolátov z daného ohniska nákazy, respektíve z individuálnych prípadov boli charakterizované prípravou fragmentov vybraných časti vírusových genómov alebo celých vírusových genómov so špecifickou PCR alebo RT-PCR. PCR produkty boli sekvenované komerčnou firmou Sangerovou metódou, chromatogramy boli editované na pracoviskách s počítačovým programom SeqMan, EditSeq, alebo Geneious. Pre fylogenetickú analýzu boli použité vybrané sekvencie z rôzných ohnísk nákazy.

Pre druhovú identifikáciu pakomárikov (Culicoides) ako možných vektorov niektorých mikroorganizmov sme využili medzidruhové fylogenetické vzťahy analyzované pomocou molekulových metód analýzou génu COI génu mitochondriálnej DNA, ktorý preukazuje nízke vnútrodruhové a vysoké medzidruhové variácie. Využili sme aj iné gény ako napr. 12S, 16S, COIa, CytB a pod. Na detekciu filárií (Onchocerca spp.) sme využili metódu real-time PCR, multiplex PCR na identifikáciu druhov z podrodu Avaritia a DNA barcoding COI génu, metóda amplifikujúca ITS-2 úsek rDNA s primermi 5.8 SF, 28 SR, Scoticus-194R, MOU-316F and Montanus-227R. Ďalej sme použili metódu amplifikujúcu ITS-1 segment rDNA, ktorá zahŕňa druhovo špecifické primery, PanCulF, Obs-sl-R, Obs-ss-R, Dewulfi-R, Montanus-R and Chiopterus- nielen na detekciu druhov z Obsoletus komplexu (C. obsoletus/C. scoticus), ale aj C. chiopterus a C. dewulfi. Sekvenácia PCR produktov bola realizovaná v Laboratóriu biomedicínskej mikrobiológie a imunológie UVLF v Košiciach. Na určenie vhodného evolučného substitučného modelu sme použili program JModelTest. Analýza algoritmu najvyššej pravdepodobnosti ML bola vykonaná programom PhyML s HKY+I+G modelom nukleotidovej substitúcie. Na rekonštrukciu fylogenetických vzťahov sme použili analýzu algoritmu najvyššej úspornosti MP v programe MEGA 5.1 metódou bootstrapping pre 10000 replikátov. Evolučné vzdialenosti medzi vzorkami boli vypočítané metódou Maximum Composite Likelihood v programe MEGA 5.1.

Počet ochorení so zoonóznym potenciálom neustále narastá a v súčasnosti je medzi zoonózy zaradených viac ako 200 infekčných a parazitárnych chorôb. K významným protozoárnym parazitozoonózam zaraďujeme giadiózu (Giardia spp.) a kryptosporidiózu (Cryptosporidium spp.). Z helmintov ľudí a zvierat sú významnými parazitmi Strongyloides stercoralis, Toxocara spp., Ancylostoma spp. Ascaris lumbricoides, Trichuris spp. a v neposlednom rade aj vektormi prenášané parazity, najmä zoonotické dirofilárie, ako aj ďalšie patogény. Na dôkaz vyššie spomínaných parazitov sme využili metódy klasické – kvalitatívne flotačné metódy, Baermannovu metódu na dôkaz lariev Strongyloides stercoralis, farbiacu metódu podľa Kinyouna na dôkaz Cryptosporidium spp.

Ďalej boli na potvrdenie diagnostiky využili sendvičovú ELISA metódu na detekciu kryptosporídiového antigénu v truse a stolici. Na stanovenie špecifických (IgG) protilátok proti S. stercoralis zo séra ľudí a mäsožravcov bol použitý test Strongyloides IgG Elisa. Na dôkaz lariev S. stercoralis bola inovovaná kultivačná metóda na agarových platniach. Na genotypizáciu asembláží Giadia duodenalis sme využívali nested PCR metódu, pre amplifikáciu triosephosphate isomerase gén (TPI). Fragment TPI génu sme získali použitím primerov AL3543 a AL3546 v prvej reakcii a AL3544 a AL3545 v druhej reakcii. Produkty PCR sme dali na sekvenáciu do Laboratória biomedicínskej mikrobiológie a imunológie UVLF.

Na diagnostiku cirkulujúcich mikrofilárií v krvi mäsožravcov bol použitý modifikovaný Knottov test. Pozitívne vzorky boli následne spracované PCR metódou za účelom druhovej diferenciácie. Krvné vzorky pochádzali od zvierat (psy, mačky, fretky) z Východoslovenského kraja. Na diagnostiku filárií v komároch sme DNA extrahovali z celých komárov a izolovali pomocou komerčného setu DNeasy® Blood and Tissue Kit (Qiagen, Nemecko). Rovnakou metódou bola izolovaná DNA zo vzoriek krvi a tkanív (slezín) mäsožravcov.

Na molekulárnu diagnostiku Dirofilaria spp. v komároch sme použili štandardnú PCR reakciu pri ktorej sme amplifikovali: COI gén D. immitis a D. repens DR COI–F1.

3. Charakterizáciu genómov vírusov, baktérii a parazitov ako aj génov laktobacilov zodpovedných za interakciu s hostiteľom

Genómy vírusov boli charakterizované prípravou fragmentov vybraných časti vírusových genómov, respektíve celých vírusových genómov so špecifickou PCR alebo RT-PCR. PCR produkty boli sekvenované komerčnou firmou Sangerovou metódou, chromatogramy boli editované na pracoviskách s počítačovým programom SeqMan, EditSeq, alebo Geneious. Pre fylogenetickú analýzu boli použité vybrané sekvencie z Gen Bank a fylogenetické stromy boli pripravené s programami MegAlign a MEGA6.

Po prvýkrát boli geneticky typizované a charakterizované BDV izoláty zo Slovenska, PRRSV z centrálno-európskeho regiónu, izoláty porcinného kobuvírusu 1 na Slovensku.

4. Štúdium diferenciálnej expresie génov a syntéza proteínov v infikovaných bunkách

V experimentoch použité Agilent Bovine (V2) GE 4x44K microarray sklíčka, ktoré obsahujú 4 samostatné array polia so 43803 sondami reprezentujúcimi okolo 20000 anotovaných génov. Na tieto sklíčka bola nanesená označená a opracovaná RNA z bovinných buniek po 36 h infekcii s cp BVDV kmeňom NADL ako aj z kontrolných buniek.

Na hodnotenie microarray dát bol použitý program GeneSpring GX 12.6.1. (Agilent, USA) s modulom Pathway Architect. Pre proteomickú analýzu bola použitá MALDI-TOF/MS spekrometra a kvantifikované s Orbitrap. Identifikácia bielkovín bola robená programom MASCOT a ich konečná identifikácia programom ICPLQuant.

V rámci vyselektovaného súboru 17348 transkriptov bolo identifikovaných 2446, ktoré vykazovali minimálne dvojnásobnú zmenu expresie (FC) v priamom porovnaní s referenčnou vzorkou (t.j. neinfikované bunky) pri p < 0,05. Väčšina z nich (1210) sa javila ako upregulovaná (p < 0,05), pričom expresia 208 génov bola zvýšená minimálne päťnásobne (p < 0,05). Expresia 1236 transkriptov bola viac ako dvojnásobne downregulovaná. Housekeeping gény (ACTB, GAPDH, HSP90AA1, RPS18, TBP) v ovplyvnenej kategórii nevykazovali významné zmeny v expresii oproti kontrole.

Výrazné zvýšenie expresie génu IL8 (FC = 157,9) a tiež OAS1X (FC = 24,7) a 2',5'-oligoadenylát syntetázy, ktorá je indukovaná interferónom, je priamou obranou buniek na vírusovú infekciu.

Najvýraznejšie zmeny boli pozorované v expresii bielkovín u BVDV1 infikovaných buniek ktoré sa zúčastňujú na apoptóze a bunkovom šoku. Naznačila to zvýšená syntéza annexinu-V a ďalšieho proteínu apoptózy – GRP78. Aj zvýšená syntéza bielkoviny HSP A5 (heat shock protein A5) je v zhode s uvedeným záverom.

5. Štúdium epitopov pre dôležite infekčné agensy

Identifikácia (mapovanie epitopov) a charakterizácia epitopov patogénov sú dôležité pri vývoji vysokošpecifických diagnostických testov, vakcín alebo pri produkcii monoklonálnych či monodoménových protilátok ako možné terapeutiká. Epitopy OspC proteínu Borrelia sp. boli mapované pomocou phage display technológie. Identifikované epitopy boli zahrnuté pri konštrukcii multiepitopového chimerického proteínu na diagnostické a vakcinačné účely. Táto chimerická molekula bola nami využitá pri diferenciálnej diagnostike Lymskej boreliózy (odlíšenie Lymskej choroby od iných neurologických infekcií a ochorení, či reumatickej artritídy)

Počas experimentálneho mapovania epitopov sa náš výskum opieral aj o predikciu epitopov a identifikáciu mimotopov. Pri in silico predikcii epitopov a ich porovnaní s experimentálne identifikovanými epitopmi boli využité viaceré bioinformatické nástroje. S využitím kombinatoriálneho phage display sa podarilo izolovať mimotopy (peptidy mimikujúce vlastnosti a funkcie epitopov), na základe ktorých bol vyvinutý test na detekciu neuroboreliózy.

Mimotopy a odvodené peptidy môžu slúžiť aj pri vývoji antibakteriálnych látok. Pomocou kombinatoriálneho phage display boli izolované a charakterizované antilisteriálne peptidy, ktoré môžu byť použité pri vývoji liečiv (alternatíva k vysokým dávkam antibiotík) pri neuroinfekciách spôsobených Listeria sp..

Experimentálne mapovanie epitopov vyžaduje zavedenie high-throughput metód, predovšetkým v prípade peptidových display knižníc (derivovaných z génových knižníc) a repertoáru protilátok či proteínov. V priebehu posledných piatich rokov bola nami vyvinutá rýchla, finančne nenáročná high-throuhput technológia pre 1. display protilátok alebo dlhších peptidových reťazcov na ribozómoch a 2. produkcia peptidov (epitopov), polypeptidov alebo funkčných proteínov (napr. chimerické epitopy)

6. Vypracovanie účinných metód potencovania špecifickej a nešpecifickej imunitnej odpovede u ľudí a zvierat na báze probiotík a imunomodulátorov, vrátane vakcín

Za účelom vypracovanie účinných metód potencovania imunitnej odpovede u zvierat na báze probiotík boli izolované prospešné baktérie z črevného traktu a kože zdravých zvierat žijúcich v naturálnom prostredí. Na základe vypracovaných selekčných kritérií boli vybrané 2 kmene Lactobacillus reuteri a 1 kmeň Kocuria kristinae z rôznych hostiteľov. Kmene sa vyznačovali produkciou exopolysacharidov (EPS), organických kyselín a reuterínu, citlivosťou na ATB, stabilitou v prítomnosti žalúdkovej šťavy a žlčových solí, schopnosťou tvoriť biofilmy, rásť pri nízkych teplotách, rezistenciou voči dermicidínu a vykazovali antagonistickú aktivitu voči patogénnym kmeňom. Následne pre účely vývoja účinnejšej aplikačnej formy probiotík bola sledovaná možnosť stabilizácie vybraných kmeňov produkujúcich EPS na naturálnom nosiči na báze alginitu. Bola testovaná vhodná fyzikálna štruktúra nosiča pre nasýtenie substrátom, substráty, kultivačné médium a kultivačné podmienky pre solid state fermentáciu za účelom sledovanie tvorby stabilných biofilmov. Na základe výsledkov, pre prípravu aplikačnej formy bola vybraná frakcia alginitu 1-1,3 mm nasýtená 40% laktózou a kultivačné médium s nižším pomerom C/N a deficitom solí. Pri týchto podmienkach testovaný kmeň Lactobacillus reuteri L2/6 vykazoval po 72 hod. kultivácii schopnosť tvoriť kompletný biofilm na alginitových zrnách. Kmeň bol v dorminantnom (kľudovom) stave s minimálnym metabolizmom a vykazoval rezistenciu na stresové podmienky (sušenie, skladovanie). Biologické pokusy boli zamerané na testovanie prežívania probiotického kmeňa v novej aplikačnej forme v tráviacom trakte modelových zvierat (myši) a sledovanie jeho biologického účinku na mikrobiologické, imunologické, biochemické a morfologické parametre po infekcii patogénnym kmeňom Salmonella Typhimurium CCM 7205. Nová aplikačná forma umožnila probiotickému kmeňu Lactobacillus reuteri L2/6 prekonať gastrointestinálnu bariéru, jeho optimálnu revitalizáciu a kolonizáciu v mikroenviromente čreva. Pasážovanie kmeňa L. reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite v hostiteľskom organizme viedlo k indukcii jeho množenia čo sa prejavilo vyššími (p0,001) počtami kmeňa v truse zvierat a dlhšou prežívateľnosťou kmeňa v tráviacom trakte v porovnaní s kontrolou. Aplikácia kmeňa L. reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite mala pozitívny vplyv na obnovu osídlenia čreva konvenčných myší laktobacilmi po liečbe ATB. Na 27. deň štúdia (5 dní od poslednej aplikácie ATB) počty celkových laktobacilov v experimentálnej skupine korešpondovali s počtami celkových laktobacilov zistenými u zvierat bez aplikácie antibiotika. Multicolor FISH analýza črevného traktu konvenčných myší po 14 dňovej aplikácii kmeňa L. reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite preukázala jeho schopnosť kolonizovať jejunum, ileum a cékum myší v prítomnosti kompetitívnej mikroflóry a pozitívne modulovať sledovanú črevnú mikroflóru so sprievodným zvýšením produkcie organických kyselín. Testovanie protektívneho účinku kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite na experimentálnu infekciu u myší preukázalo v periférnej krvi, v mezenteriálnych lymfatických uzlinách a v slezine signifikantné zvýšenie fagocytárnej aktivity (p<0,001) a signifikantne vyšší pomer CD4:CD8, ako aj vyššie zastúpenie dvojitopozitívnych CD4+CD8+ lymfocytov (p<0,01) v laktobacilovej skupine oproti kontrole čo svedčí o imunostimulácii. Laktobacily tiež štatisticky významne (p<0,001) zvýšili zastúpenie B-lymfocytov v periférnej krvi. Imunostimulácia po aplikácii Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite na úrovni bunkovej imunitnej odpovede bola potvrdená aj prostredníctvom relatívnej génovej expresie mRNA jednotlivých cytokínov (TGF-β, TNF-α, MCP-1, IL-1β) použitín qPCR. Lactobacillus reuteri L2/6 signifikantne zvýšil expresiu génu pre TGF-β (p<0,01), TNF-α (p<0,001), IL-1β (p<0,001), MCP-1 (p<0,01). Signifikantná redukcia (p˂0,05) počtov S. Typhimurium v pečeni a v slezine laktobacilovej skupiny oproti pozitívnej kontrole bola pozorovaná na 7. deň od infekcie. Histologická analýza pečeňového parenchýmu myší po 14 dňovej aplikácii preukázala vplyv kmeňa L. reuteri L2/6 na zmiernenie postinfekčného poškodenia pečeňového parenchýmu myší. V laktobacilovej skupine bola na 7. deň po infekcii S. Typhimurium pozorovaná významne nižšia (p˂ 0,05) intenzita zápalových ložísk, ktoré mali charakter špecifického granulačného ložiska.

Ďalším cieľom bolo sledovať vplyv probiotického kmeňa Enterococcus faecium AL41 na cekálnu slizničnú imunitu kurčiat po infikovaní Campylobacter jejuni náš experiment preukázal mierne zvýšený počet IgA+ buniek v céku kurčiat, ktorým bol aplikovaný probiotický kmeň EFAL41 oproti kontrole a CJ skupine (P<0,05) 4 dni po infekcii. Sedem dní po infekcii sme zaznamenali najvyšší počet IgA+ buniek v skupine, v ktorej bol aplikovaný probiotický kmeň EFAL4 a tiež v kombinovanej EFAL41+CJ skupine (P < 0,001). Najvyšší počet IgM+ buniek bol pozorovaný v CJ skupine kurčiat v porovnaní s kontrolou, kombinovanou skupinou EFAL41+CJ (P < 0,001) a probiotickou skupinou EFAL41 (P < 0,01) 4 dni po podaní C. jejuni. Sedem dní po infekcii boli počty buniek signifikantne zvýšené vo všetkých skupinách v porovnaní s kontrolou (p < 0,001). Najvyššia hustota CD3+ lymfocytov bola v prvom odbere v skupine kurčiat s aplikovaným probiotickým kmeňom EFAL41, oproti CJ (P < 0,01) a EFAL41+CJ skupinám (P < 0,05), čo poukazuje na pozitívny vplyv na túto subpopuláciu lymfocytov. V neskorej fáze infekcie bol najvyšší počet CD3+ buniek zaznamenaný v EFAL41+CJ skupine (P < 0,001).

Relatívna expresia IL-6 bola zvýšená v EFAL41+CJ skupine v porovnaní s ostatnými skupinami 4 aj 7 dní po infekcii. Naše výsledky preukázali pozitívny vplyv E. faecium AL41 na počety IgA+, IgM+ a CD3+ lymfocytov v céku u kurčiat infikovaných C. jejuni.

Z dôvodu častého výskytu zoonózy Campylobakteriózy u ľudí sme sledovali výskyt Campylobacter .spp. u sliepok ako častého prenášača tejto choroby. Z chovov sliepok chovaných pri rôznych spôsoboch chovu bol sledovaný výskyt špecifických protilátok proti Campylobacter spp. Na hodnotenie bol použitý komerčný ProspecTtm Campylobacter kit (Oxoid, USA). Absorbancia bola meraná spektrofotometricky pri 450 nm ELISA readrom (Revelation Quicklink, Opsys MR, Dynex technologies, USA).Výskyt protilátok proti Campylobacter spp. bol zistený u všetkých farmových chovoch hydiny. V každom zo 6 hodnotených chovov bol zistený aspoň jeden prípad s výskytom protilátok k hodnotenej baktérii. Výsledky však neboli štatisticky rozdielne medzi jednotlivými hodnotenými chovmi sliepok. Najnižšie hodnoty v našom pokuse boli zaznamenané v chovoch, ktoré mali voľný výbeh. Toto zistenie by mohlo súvisieť s časom odberu vzoriek – jarné mesiace, v ktorých je výskyt patogénnych baktérií C. spp. v prostredí nízky. Možný vplyv na nižšiu frekvenciu výskytu protilátok proti C. spp. zohral aj rôznorodý príjem krmiva počas vegetačného obdobia.

Pre získanie viac informácii o interakcii anorganickej resp. organickej formy zinku a probiotickej baktérie Lactobacillus reuteri B6/1 on expresiu IL-18, IL-8, NF-κB a MyD88 sme použili in vitro model na IPEC bunkovej kultúre. In vitro výsledky preukázali, že organická forma zinku v interakcii s Lactobacillus reuteri B6/1 bola efektívnejšia pri modulácii prozápalových cytokínov v porovnaní s anorganickým zinkom.

Boli vyvinuté a testované adjuvantné adjuvantné vakcíny proti besnote v jednom kroku. Testované adjuvantné formulácie na základe skvalénu alebo skvalánu ako olejovej zložky adjuvantnej vakcíny sa ukázali byť vhodné a účinné aj pre mukozálne použitie v kombinácii s antirabickou vakcínou.